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水蛭素结构及活性

 日期:2014-11-20 17:47:05 浏览次数:2002

五、水蛭素结构及活性

1、水蛭素的结构:?20世纪60年代发展了天然水蛭素的分离和纯化技术,得出水蛭素是由65个氨基酸组成的低分子多肽,其分子量仅为7000D。20世纪70年代确证了肽链的组成和一级结构。20世纪80年代完成了二级和三级结构分析。N端有3个二流桥,使N端肽链绕迭成密集形核心环肽链结构。C端富含酸性氨基酸残基,局亲水性,游离在分子表面。肽链中部还有一个由pro-lys47-pro组成的特殊序列,不被一般蛋白酶所降解。水蛭素的活性作用机制:水蛭素是现在知道的最强的凝血酶特异性抑制剂,带负电荷的C端结构再凝血酶的带正电荷的纤维蛋白原识别位点,最小保持抗凝活性的片段为酸性C端的10-12个肽段,C端12具有最大活性的最小肽段。N端密集链段则同凝血酶催化位点结合,抑制凝血酶的催化作用。Tyr-63的硫酸化可提高凝活性,The56,Glu57,lle59是抗凝中必不可少的,水蛭素4位赖氨酸残基同靠近凝血酶催化位点附近的精氨酸侧链(ArgSide?Chain?Pocket)代夫电话的碱基,起着促进N端与活性位点结合等重要作用,lys47也通过氢键和静电两种作用力同时影响水蛭素的三维结构。2个分子结合比例为1:1,解离常数为K=2.3×10-14mol/L,故复合物非常稳定,使凝血酶不能分解纤维蛋白原,及不能诱导血小板反应,也使凝血酶的刺激成纤维细胞增生和平滑肌细胞收缩缝作用受抑制,从而达到抗凝的效果。

参考文献:陈华友、黄静、蒋芝君、刑自立、吴自荣.?抗凝良药水蛭素的研究进展[J].生命学通报,2003,38(3):3-5。

2、1955?,前东德科学家Markwardt?分离出高纯度水蛭素,经鉴定它是一种含65?-?66?个氨基酸的单链多肽,分子量为7000?,对凝血酶有高度的亲和力,并以11的方式与之形成紧密的非共价键相结合的可逆性复合物,使凝血酶失去裂解纤维蛋白原的能力,阻止纤维蛋白的凝固,减少凝血酶催化的凝血反应(如因子Ⅴ、Ⅷ、Ⅻ的活化)?及凝血酶诱导的血小板反应。静脉注射水蛭素0.?1?mg/?kg?或皮下注射相同剂量的水蛭素,60?min?后血液中的水蛭素浓度即

开始增加,5?h?后逐渐下降,水蛭素大多以活性形式通过肾脏排出。????参考文献:殷国前,孙智勇,杨晓楠,杨健祥,王 刚,滕晓颦.?水蛭及水蛭素再度风行的生物疗法.?中国美容整形外科杂志[J].2007.8,18(8):305-307.

4、结构:是一条含65或66个氨基酸残基的单链多肽,贩子质量为7ku,其N末端有3对二硫键(Cys6-?Cys14,?Cys16-?Cys28,?Cys32-?Cys39),使肽链绕叠成密集形核心环肽结构,对蛋白结构起稳定作用。其N末端含活性中心,能识别底物-凝血酶碱性氨基酸富集位点,并与之结合。C末端富含酸性氨基酸残基,最后9个氨基酸中有6个为酸性氨基酸。天然水蛭素第63位的络氨酸残基被硫酸化,而重组水蛭素没有这个特殊的结构,因此后者抗凝比活性有所下降。水蛭素肽链中部还有一个由pro-lys47-pro组成的特殊序列,不被一般蛋白酶所降解。有两个作用:①维持水蛭素分子的稳定性;②引导水蛭素分子以正确的方向与凝血酶分子结合。

参考文献:[1]、张士斌.?水蛭素的基础研究现状及临床应用展望.北京医学[J],2008,28(3):173-175.

[2]、杨丽娅,高菂水蛭素与凝血酶作用的探讨.?西北药学杂志 2007.4,22(2):95-96.?

5、重组水蛭素的结构:重组水蛭素recombinant?hirudin)与天然水蛭素的结构极其相似,也是由65个氨基酸残基组成的多肽,但在63位酪氨酸残基上无硫酸。它的一级结构具有C端谷氨酸和门冬氨酸含量丰富的特点,肽链中有多个半胱氨酸残基,序列中第27、36、47位是赖氨酸。空间结构与天然的相同:其核心区由氨基酸3-30、37-46、56-67三个肽段组成,指状区由31-37肽段组成,C端尾区由50-65肽段组成。????

参考文献:[1]王鸿利,于立志.水蛭素的基础与临床.血栓与止血学杂志[J],1998,5(2):86-88、61????

[2]张国龙.水蛭素的研究及临床应用进展.?江苏药学与临床研究[J].2003,11(6):15-17

6、水蛭素是含65个氨基酸的多肽,?分子量为7000左右,?含三个二硫键。已分离鉴定出7种异构体?,水蛭素的=级和三级结构对其抗凝活性起决定性作用。二硫键是决定其分子构型的稳定性,?保持高抗凝活性的关键?。当二硫桥键被氧化或还原,?或者分子发生了蛋白降解,?则失去抗凝活性。若水蛭素的羧基被酯化,?或失去酸性的C一端氨基酸,?也会失去与凝血酶结合的能力?。研究表明.?水蛭素与凝血酶活性位置结合的结构单元仅存在于C?端残基中,?水蛭素的?一端虽无与凝血酶结合的位置,但结合到凝血酶上的水蛭素的N一端残基亦有抑制凝血酶催化活性的作用水蛭素N一端构型对其同凝血酶作用的影响,发现N一端残基的疏水性结构对水蛭素抗凝血酶作用有重要影响。水蛭素在干燥状态下是稳定的,?室温下在水中稳定存在6个月.8O?下加热15min不被破坏。提高溶液的pH值,其稳定性则降低。20℃下,在0.1mol/L?HCL或0.1mol/L?NaOH中,可稳定15min。胰蛋白酶钠和α-糜蛋白酶不破坏水蛭素的活性,?而番木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶A可使水蛭素失去活性。???

参考文献:欧暑长?丁家欣??玲.?水蛭素的研究概况.中国药学杂志[J].1991,26(7):396-399.

7、水蛭素的组成结构:水蛭索~hirudinHV)共有7个异构体,是一种单链环肽化合物。肽链由65个氨基酸残基组成,相对分子量为7000道尔顿。分子N?端有三个二硫桥键(SS)。使N?端肽链绕迭成密集形核心环肽结构。C端富含酸性氨基酸残基.63位的酪氨酸被硫酸化(TyrSOH)?。水蛭素存在十种以上变异体.主要的三种简称为HV1HV2HV3。其氨基酸序列如下所示。

HV1VVYDTCTESGQNLCLCEGSNVCGQGNKCILGSDGEKNQCVTGEGTPKPQSHNDGDFEEIPEEYLQ

HV2ITYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGKGNKCILGSNGKGNQCVTGEGTPNPESHNNGDFEE1PEEYLQ

HV3ITYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGKGNKCILGSNGKGNQCVTGEGTPKPQSHNQGDFEEPIPEDAYDE

这些变异体主要差别是N?端氨基酸序列不同,但都具有相似的抗凝活性。??

参考文献:高雪涛,段志强,高?晶.?水蛭素的应用及研究进展.?黑龙江医药[J].2003,16(1):38.

8、水蛭素的稳定性:加热0???5?h,?大部分水蛭素活性丧失。水蛭素粗提物制备过程中(包括冷冻真空干燥处理)?始终保持低温状态,?所得水蛭素粗提物在干燥状态下非常稳定。中医药学药理及临床试验证明:?水蛭系列产品生服效果显着高于熟服。体外抗凝血试验亦表明,?冰水状态下保存3?a其活性仅降低约15%,?室温下在水中可稳定存在180?d,?80度以下加热15min不被破坏。胰蛋白酶钠、糜蛋白酶不破坏水蛭素活性;?木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶A?可使水蛭素失去部分活性。??

参考文献:杨恩昌,水蛭素可利用性分析,河北农业科学,2010,14(7):52-53.


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